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TSD: INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA DIFERENCIACIÓN DE LAS
GÓNADAS EN EMBRIONES DE TORTUGA.
Txema López, 2007
En un artículo ya publicado
con anterioridad en Testudinae.com,
desgranábamos cómo las causas ambientales influían en la
diferenciación sexual de los reptiles ovíparos en general y de las
tortugas en particular. Vimos que la mayoría de las tortugas
mostraban diferenciación sexual por
temperatura (TSD),
y algunas pocas especies,
diferenciación genética (GSD)
al estilo de los mamíferos, pero con mecanismos mucho más primitivos.
Esta diferenciación de las gónadas, bien en ovarios o testículos,
tiene lugar durante la primera mitad del primer tercio de la
incubación, un periodo crítico dentro del desarrollo embrionario
denominado periodo termosensitivo
(TSP).
Varios tratamientos realizados al embrión durante el TSP han
demostrado la implicación de los
estrógenos en la diferenciación
gonadal. Los estrógenos son hormonas sexuales de tipo femenino
producidos por los ovarios y, en menores cantidades, por las glándulas
adrenales. Los estrógenos
inducen fenómenos de proliferación celular sobre los órganos diana,
por lo que un tratamiento con estrógenos exógenos de un embrión a
temperatura de incubación de machos da lugar a la diferenciación
ovárica, produciendo, por tanto, hembras, mientras que un tratamiento
con antiestrógenos o inhibidores de la
aromatasa da
lugar a la diferenciación testicular a temperatura de incubación de
hembras. La aromatasa
es una enzima de la superfamilia del Citocromo P450, cuya función es
aromatizar andrógenos (hormonas masculinas) selectivamente. Una
enzima es un biocatalizador, es decir, una substancia que permite
reacciones químicas complejas a temperatura ambiente y presión
atmosférica, las llamadas condiciones vitales. La
aromatización es
una reacción química consistente en crear un ciclo aromático, donde
las moléculas de carbono se unen formando enlaces dobles y simples
alternativamente, dándose un fenómeno de resonancia, es decir,
creándose una zona de libre circulación de electrones entre los átomos
de carbono del ciclo, en una molécula susceptible de tenerlo. El
benceno es una molécula aromática simple donde ocurre este fenómeno:
1.
Molécula de benceno, mostrando la disposición de los orbitales P del
carbono, de tal manera que existe una zona de libre circulación de
electrones a lo largo de todo el ciclo.
2. Reacción de aromatización de la testosterona
(andrógeno) en estradiol (estrógeno) catalizada (causada) por la
aromatasa.
Se han realizado una serie
de estudios buscando contenido de estrógenos, actividad de aromatasa y
expresión génica de la aromatasa en los complejos GAM
(gonadal/adrenal/mesonéfrico) (zona de tejido que debe diferenciarse)
durante el desarrollo embrionario de tortugas y cocodrílidos. En sólo
uno de esos estudios se encontraron diferencias entre temperaturas de
generación de macho y de hembra durante el TSP. En otros estudios, se
encontraron diferencias al final del TSP o no fueron encontradas
durante y después del TSP. Por tanto, muchos autores determinaron que
los estrógenos no estaban implicados de manera alguna en los estadios
más tempranos de la diferenciación ovárica. Otros autores infirieron
que la temperatura influye en tejidos extragonadales, en particular el
adrenal y/o el mesonéfrico, ya que estos tejidos pueden ser el origen
de los estrógenos que actúan en la diferenciación de las gónadas.
Pieau y Dorizzi analizaron datos provenientes únicamente de las
gónadas, en particular de galápagos y tortugas marinas, en las que no
hay implicación de tejidos extragonadales. Este análisis concluyó que:
-
La temperatura
influye directamente en la diferenciación sexual de las gónadas.
-
Durante el TSP, la
actividad de la aromatasa en las gónadas depende de la temperatura
de incubación de los huevos.
-
Los estrógenos son
sintetizados en las gónadas durante el TSP y que esa síntesis
depende de la temperatura.
-
Los estrógenos actúan
tanto en la parte cortical de las gónadas como en la medular.
Con todos estos datos, se
puede inscribir la TSD en un concepto más amplio, el de la
diferenciación sexual gonadal. Podemos ir analizando y razonando cada
uno de esos puntos, no sin antes repasar los eventos clave del
desarrollo embrionario de una tortuga. Para facilitar la comparación
en el desarrollo embrionario de las diferentes especies,
particularmente para la familia
Emydinae, existe un esquema estandar
de 27 etapas en el desarrollo embrionario, inicialmente presentado
para Trachemys scripta (Greenbaum,
2002). Las primeras etapas son
prácticamente iguales para todos los taxones de tortugas, y sólo hay
cambios significativos entre las etapas 12 y 26. No vamos a entrar en
profundidad a enumerar las diferentes etapas del desarrollo,
simplemente comentaremos que la definición de cada etapa está basada
en el desarrollo de los miembros delanteros y la garras del embrión en
formación, y que la primera clasificación de este tipo se hizo para
Chelydra serpentina
en un trabajo de Yntema (1968).
En los artículos comentados en la
revisión de Pieau y Dorizzi la mayoria de los datos vienen de estudios
realizados en Emys orbicularis (galápago europeo), Lepidochelys
olivacea (tortuga golfina) y Dermochelys coriacea (tortuga laud). En
el siguiente gráfico ilustramos los principales eventos morfológicos
que tienen lugar en el desarrollo de Emys orbicularis:
3. Etapas
principales de la diferenciación de gónadas en relación con la edad y
etapa del desarrollo embrionario de Emys orbicularis, comparadas con
las de Dermochelys coriacea, según Renous et al.(1989) y Desvages et
al. (1993).
La temperatura
pivotal de esta especie es de 28,5ºC, con lo que, a una temperatura de
25ºC obtendríamos un 100% de machos y a 30ºC un 100% de hembras. El
TSP se extiende entre las etapas 16 y 22. Antes de llegar a este
punto, las gónadas son indiferentes, o dicho de otra manera,
bipotenciales. Están compuestas de
epitelio germinal . El
epitelio es el
tejido formado por una o varias capas de células yuxtapuestas que
constituyen el recubrimiento interno de las cavidades, órganos huecos,
conductos del cuerpo y la piel y que también forman las mucosas y las
glándulas. Los epitelios también forman el parénquima de muchos
órganos, como el hígado. El epitelio germinal es el que forma la línea
germinal. La línea germinal
o estirpe germinal
es el conjunto de células localizadas en las gónadas, que se
convierten en gametos (óvulos y espermatozoides) a través de una
división celular que sólo ocurre en las gónadas que es la meiosis. En
la parte interior, sin embargo, están compuestas por finos cordones de
células epiteliales, los llamados “cordones
sexuales”, entre
tejido mesenquimal
(El tejido mesenquimal, genéricamente denominado mesénquima es el
tejido del organismo embrionario, de tipo conjuntivo laxo: con una
abundante matriz extracelular, compuesta por fibras delgadas y
relativamente pocas células, aunque la celularidad es muy variable). A
25ºC, los primeros signos histológicos (relativo a los tejidos) de
diferenciación de los cordones
testiculares, los futuros cordones seminíferos aparecen en la
etapa 17. Durante el TSP, el epitelio germinal se aplana, y las
células germinales lo abandona para migrar entre las células
epiteliales de los cordones testiculares. A 30ºC, cuando se
diferencian las células femeninas, durante el TSP los cordones
sexuales se vuelven finos, aparecen fragmentados o evolucionan como
pequeñas lacunae
(del latin lacuna,
en histología, un pequeño espacio), mientras que el epitelio germinal
se transforma en córtex ovárico, cuyo desarrollo es principalmente
debido al desarrollo in situ de células germinales. Al final del TSP,
algunas células germinales entran en proceso de
meiosis. En
biología, meiosis
(proviene del latín “hacer mas pequeño”) es un proceso divisional
celular , en el cuál una célula diploide (2n), experimentará dos
divisiones celulares sucesivas, con la capacidad de generar cuatro
células haploide (n).
Este proceso se
lleva a cabo en dos divisiones nucleares y citoplasmáticas, llamadas,
primera y segunda división meiótica o simplemente Meiosis I y Meiosis
II. Ambas comprenden Profase, Metafase, Anafase y Telofase. Durante la
meiosis I los miembros de cada par homólogo de cromosomas se unen
primero y luego se separan y se distribuyen en diferentes núcleos. En
la Meiosis II, las cromátidas hermanas que forman cada cromosoma se
separan y se distribuyen en los núcleos de las células hijas. Entre
estas dos etapas sucesivas no existe la etapa S (duplicación del ADN).
Los errores en la
meiosis son responsables de las principales anomalías cromosómicas. La
meiosis consigue mantener constante el número de cromosomas de las
células de la especie para mantener la información genética.
1. La
temperatura influye directamente en la diferenciación sexual de las
gónadas.
El efecto directo
de la temperatura en la formación de las gónadas se demostró por
experimentos llevados a cabo in vitro con la tortuga golfina,
Lepidochelys olivacea.
Los huevos incubados a 26ºC dan lugar a machos y los incubados a 33ºC
resultan ser hembras. La masculinización de las gónadas fue
caracterizada por la expresión génica
de la proteína SOX9 durante el
desarrollo embrionario normal. Entre las etapas 21 y 24 del desarrollo
embrionario, la SOX9 se expresa a ambas temperaturas en las gónadas,
que permanecen en estado bipotencial. Posteriormente, SOX9 sigue dando
positivo a 26ºC en los cordones medulares de las gónadas masculinas ya
diferenciadas. Este comportamiento se observa tanto en ensayos
in ovo (dentro
del huevo) como in vitro
(tejido gonadal artificialmente propagado). La
expresión génica
es el proceso por medio del cual todos los organismos procariotas y
eucariotas transforman la información codificada en los ácidos
nucleicos en las proteínas necesarias para su desarrollo y
funcionamiento. En todos los organismos, inclusive los eucariotes el
contenido del ADN de todas sus células es idéntico. Esto quiere decir
que contienen toda la información necesaria para la síntesis de todas
las proteínas. Pero no todos los genes se expresan al mismo tiempo ni
en todas las células. Hay sólo un grupo de genes que se expresan en
todas las células del organismo y codifican para proteínas que son
esenciales para el funcionamiento general de las células y son
conocidos como "housekeeping genes". El resto de los genes se expresan
o no en los diferentes tipos de células, dependiendo de la función de
la célula en un tejido particular. Por ejemplo, genes que codifican
proteínas responsables del transporte axonal se expresan en neuronas
pero no en linfocitos en donde se expresan genes responsables de la
respuesta inmune. También existe especificidad temporal, esto quiere
decir que los diferentes genes en una célula se encienden o se apagan
en diferentes momentos de la vida de un organismo. Además, la
regulación de los genes varía según las funciones de éstos. De alguna
manera, pues, la temperatura influye en la expresión de la SOX9, y por
tanto muestra el claro efecto de ésta en la diferenciación sexual de
las gónadas.
2. Durante el
TSP, la actividad de la aromatasa en las gónadas depende de la
temperatura de incubación de los huevos.
Como antes
decíamos, la aromatasa es el complejo enzimático que transforma los
andrógenos en estrógenos. En diversos experimentos se midió la
actividad de la aromatasa en las gónadas, separadas de los complejos
GAM de las especies Emys orbicularis
y Dermochelys coriacea.
En el primer caso, se midió a 25ºC y a 30ºC. Al principio del TSP, la
actividad de la aromatasa es muy baja en ambos casos, pero era algo
superior a 30ºC. Sin embargo, a medida que avanza el TSP la actividad
de la aromatasa crece exponencialmente, alcanzándose un pico al final
del desarrollo embrionario dando como resultado la diferenciación del
tejido y la formación de ovarios. Se observó también que la actividad
de la aromatasa a la temperatura pivotal de 28,5ºC en
testes y
ovotestes (testes
es el plural de testis,
testículo en latín ) era algo superior que la observada en testículos
a 25ºC e inferior en ovarios a 30ºC. Sin embargo, estas condiciones
ideales en que la temperatura se mantiene durante el TSP son poco
dadas a ocurrir en la naturaleza. ¿Qué ocurre si invertimos la
temperatura de incubación de embriones de macho a hembra y de hembra a
macho? Hecho el experimento en diferentes estadios del TSP, un aumento
o un descenso de la temperatura se traducía en un aumento o descenso
simultáneo de la actividad de la aromatasa. Los cambios inducidos
después del TSP no producían efecto alguno. Además, los experimentos
demostraron que la temperatura actúa sobre la regulación síntesis de
la aromatasa y no sobre la propia actividad de la proteína.
Resultados similares se obtuvieron para
Dermochelys coriacea,
para la que un cambio de 27ºC a 35ºC durante la incubación, que tuvo
lugar a 27ºC entre las etapas 22 y 29, y luego a 35ºC durante 6
días, produjo cambios importantes en la actividad de la aromatasa
sólo entre las etapas 23 y 27. En el caso de
Lepidochelys olivacea,
se observaron cambios en la expresión de la proteína SOX9 durante ese
mismo periodo. Por tanto, el periodo sensible a los cambios de
temperatura que induce cambios en la actividad gonadal de la aromatasa
en la tortuga laúd, y la expresión de la proteína SOX9 en la tortuga
golfina coincide con el TSP para la diferenciación sexual de las
gónadas en el galápago europeo.
3. Los
estrógenos son sintetizados en las gónadas durante el TSP y esa
síntesis depende de la temperatura.
Ya desde una
etapa muy temprana, se observa que la esteroidogenesis comienza muy
pronto en el desarrollo embrionario. Esto es muy importante, puesto
que tanto los estrógenos como los andrógenos son de naturaleza
esteroidea. Esto ocurre para
Emys orbicularis
a partir de la etapa 15, antes del TSP, donde ya se observa actividad
de la 3β-HSD,
una enzima que actúa sobre los esteroides. Esta hormona tiene en esta
etapa más actividad a temperatura de producción de machos. Dado que
las gónadas sintetizan estrógenos tan pronto como al principio del TSP,
y la síntesis de estos depende de la temperatura durante este periodo,
se puede inferir que sólo los estrógenos generados en las gónadas (de
origen endógeno,
no como los generados en el cerebro o los contenido en la yema del
huevo, de origen exógeno)
actúan en la TSD.
4.Los estrógenos
actúan tanto en la parte cortical de las gónadas como en la medular.
Para los reptiles
en general, al final del desarrollo embrionario el epitelio
superficial de los testes
es muy fino, pero pueden quedar restos de epitelio germinal, quedando
por tanto células germinales en él. El tratamiento con estrógenos de
tortugas juveniles o recién nacidas (Malaclemys
terrapin, Risley 1941,
Mauremys leprosa,
Vivién y Stefan 1958) induce la proliferación y entrada en meiosis de
esas células germinales, produciéndose el desarrollo de córtex
ovárico a partir del epitelio germinal, siendo este proceso controlado
por estrógenos. Sin embargo, este proceso no destruye los cordones
testiculares de la parte medular de las gónadas.
En la época del
descubrimiento de la TSD, se hicieron experimentos inyectando
estrógenos a temperatura de producción de machos en huevos de
Testudo graeca
y Emys orbicularis,
observándose la inhibición del desarrollo de los cordones
testiculares a etapas tempranas del desarrollo. Esa inhibición es
proporcional a la dosis de estrógenos inyectada. En todos los casos se
formaba córtex ovárico, lo cual no quiere decir que se formasen
ovarios completos y funcionales en todos los casos (en muchas
ocasiones se observaban hipoovarios u ovotestes). El periodo durante
el cual este tratamiento es efectivo coincide con el TSP.
También se han
realizado los experimentos contrarios, suministrar antiestrógeno o
inhibidores de la aromatasa a temperatura de producción de hembras.
Los tratamientos con Tamoxifen, un antiestrógeno en
Emys orbicularis,
y con los inhibidores de la aromatasa Fadrozol o Letrozol en
Emys orbicularis, Trachemys scripta y
Chelydra serpentina,
dieron como resultado la diferenciación de los cordones testiculares
en gónadas masculinas a temperatura de producción de hembras. Incluso
después del TSP, el tratamiento con Letrozol funciona con el galápago
europeo, pero menos efectivamente.
Conclusión
Tomando todo esto
en cuenta, para todos los reptiles que muestran TSD, las gónadas son
las que sufren los efectos de la temperatura para que se produzca la
diferenciación sexual, y son el lugar donde tiene lugar la acción de
la aromatasa y de la síntesis de estrógenos durante el TSP. La
síntesis de los estrógenos gonadales depende de la temperatura de
incubación. A temperaturas de producción de hembras, a etapas
tempranas del TSP los estrógenos endógenos actúan tanto en la parte
medular como en la cortical de la gónada para producir la
diferenciación sexual de los ovarios.
La
termosensibilidad en la diferenciación sexual de las gónadas se ha
observado también en peces y en anfibios, no sólo en reptiles. En
estas especies no se distinguen cromosomas mitóticos sexuales
por métodos clásicos, sin embargo su detección es posible, y eso
implica que los efectos de la temperatura se imponen a la
determinación genética del sexo (GSD).
Bibliografía
Greenbaum, E. Can.
J. Zool. 80(8):
1350–1370 (2002)
Pieau, C., Dorizzi,
M. Journal of Endocrinology 181:
367-377 (2004)
Torres
Maldonado, L.C., Merchant Larios, H., Ciencia ergo Sum
13(2):176-182
(2006)
Wikipedia (http://www.wikipedia.org)
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